Hoe Lichtmicroscopen Werken

{h1}

Het menselijk oog mist veel - betreedt de ongelooflijke wereld van het microscopische! Ontdek hoe een lichtmicroscoop werkt.

Sinds hun uitvinding aan het eind van de 16e eeuw hebben lichtmicroscopen onze kennis op het gebied van fundamentele biologie, biomedisch onderzoek, medische diagnostiek en materiaalwetenschap verbeterd. Lichtmicroscopen kunnen objecten tot 1.000 keer vergroten, waardoor microscopische details zichtbaar worden. Lichtmicroscopietechnologie is ver geëvolueerd tot ver buiten de eerste microscopen van Robert Hooke en Antoni van Leeuwenhoek. Speciale technieken en optica zijn ontwikkeld om de structuren en biochemie van levende cellen te onthullen. Microscopen zijn zelfs het digitale tijdperk ingegaan, met behulp van ladinggekoppelde apparaten (CCD's) en digitale camera's om foto's te maken. Toch lijken de basisprincipes van deze geavanceerde microscopen sterk op die van de studentenmicroscoop die je misschien in je eerste biologieles hebt gebruikt.

In deze editie van Hoe dingen werken, we zullen de kleine wereld van lichtmicroscopen betreden en de verschillende technologieën onderzoeken die hen laten zien wat anders niet op te sporen is voor het menselijk oog.

De basis

Diagram van een typische studentenlichtmicroscoop, die de delen en het lichtpad toont

Diagram van een typische studentenlichtmicroscoop, die de delen en het lichtpad toont

Een lichtmicroscoop werkt heel erg als een brekende telescoop, maar met wat kleine verschillen. Laten we kort bekijken hoe een telescoop werkt.

Een telescoop moet grote hoeveelheden licht verzamelen van een vaag, ver verwijderd object; daarom heeft het een grote nodig objectieve lens om zoveel mogelijk licht te verzamelen en het helder te krijgen. Omdat de objectieflens groot is, brengt het het beeld van het object op enige afstand dichterbij, waardoor telescopen veel langer zijn dan microscopen. Het oculair van de telescoop vergroot dan dat beeld terwijl het het aan je oog brengt.

In tegenstelling tot een telescoop, moet een microscoop licht verzamelen uit een klein gebied van een dun, goed verlicht specimen dat zich in de buurt bevindt. Dus de microscoop heeft geen grote objectieflens nodig. In plaats daarvan is de objectieflens van een microscoop klein en bolvormig, wat betekent dat het aan elke kant een veel kortere brandpuntsafstand heeft. Het brengt het beeld van het object op korte afstand binnen de buis van de microscoop in beeld. Het beeld wordt vervolgens vergroot door een tweede lens, genaamd een oculaire lens of oculair, zoals het aan je oog wordt gebracht.

Het andere grote verschil tussen een telescoop en een microscoop is dat een microscoop een heeft lichtbron en een condensator. De condensor is een lenssysteem dat het licht van de bron op een kleine, heldere plek van het object scherpstelt, wat hetzelfde gebied is dat de objectieflens onderzoekt.

Ook in tegenstelling tot een telescoop met een vaste objectieflens en verwisselbare oculairs, hebben microscopen meestal onderling verwisselbare objectieflenzen en vaste oculairs. Door de objectieflenzen te veranderen (van relatief platte doelen met een lage vergroting tot rondere doelen met een hoge vergroting), kan een microscoop steeds kleinere gebieden in beeld brengen - licht verzamelen is niet de primaire taak van de objectieflens van een microscoop, omdat het is een telescoop.

We zullen later in het artikel de delen van een microscoop gedetailleerd bekijken.

Maak een eenvoudige microscoop

U kunt een eenvoudige microscoop maken met behulp van vergrootglazen en papier:

  1. Krijg twee vergrootglazen en een vel bedrukt papier.
  2. Houd een vergrootglas op korte afstand boven het papier. Het beeld van de afdruk ziet er iets groter uit.
  3. Plaats het tweede vergrootglas tussen uw oog en het eerste vergrootglas.
  4. Beweeg het tweede glas omhoog of omlaag totdat de afdruk scherp wordt weergegeven. U zult merken dat de afdruk groter lijkt dan in het eerste vergrootglas.

Je kunt ook een eenvoudige pinhole-microscoop maken die werkt als een gaatjescamera. Zie TOPScopes voor meer informatie.

Beeldkwaliteit

Afbeelding van stuifmeelkorrel onder goede helderheid (links) en slechte helderheid (rechts)

Afbeelding van stuifmeelkorrel onder goede helderheid (links) en slechte helderheid (rechts)

Wanneer u een exemplaar bekijkt met een microscoop, wordt de kwaliteit van de afbeelding die u ziet als volgt beoordeeld:

  • Helderheid - Hoe licht of donker is het beeld? De helderheid is gerelateerd aan het verlichtingssysteem en kan worden gewijzigd door de spanning naar de lamp (rheostaat) te veranderen en de condensor en diafragma / pinhole-openingen aan te passen. Helderheid is ook gerelateerd aan de numerieke lensopening van de objectieflens (hoe groter de numerieke lensopening, hoe helderder het beeld).
  • Focus - Is het beeld wazig of goed gedefinieerd? Focus is gerelateerd aan brandpuntsafstand en kan worden bediend met de focusknoppen. De dikte van het dekglas op de objectglaasje kan ook van invloed zijn op uw vermogen om het beeld te focussen - het kan te dik zijn voor de objectieflens. De juiste dikte van het dekglas staat op de zijkant van de objectieflens.

Hoe lichtmicroscopen werken: licht

Afbeelding van stuifmeelkorrel in focus (links) en onscherp (rechts)
  • Resolutie - Hoe dicht kunnen twee punten in de afbeelding zijn voordat ze niet meer als twee afzonderlijke punten worden gezien? Resolutie is gerelateerd aan de numerieke lensopening van de objectieflens (hoe hoger de numerieke lensopening, hoe beter de resolutie) en de golflengte van het licht dat door de lens gaat (hoe korter de golflengte, hoe beter de resolutie).

Hoe lichtmicroscopen werken: werken

Afbeelding van stuifmeelkorrel met goede resolutie (links) en slechte resolutie (rechts)
  • Contrast - Wat is het verschil in belichting tussen aangrenzende gebieden van het monster? Het contrast is gerelateerd aan het verlichtingssysteem en kan worden aangepast door de intensiteit van het licht en de diafragma / pinhole-opening te wijzigen. Ook kunnen chemische vlekken die op het monster worden aangebracht het contrast verbeteren.

Hoe lichtmicroscopen werken: werken

Afbeelding van stuifmeelkorrel met goed contrast (links) en slecht contrast (rechts)

In de volgende sectie zullen we het hebben over de verschillende soorten microscopie.

Typen microscopie

Lichtpad van een fasecontrastmicroscoop

Lichtpad van een fasecontrastmicroscoop

Een groot probleem bij het waarnemen van monsters onder een microscoop is dat hun afbeeldingen niet veel contrast hebben. Dit geldt vooral voor levende dingen (zoals cellen), hoewel natuurlijke pigmenten, zoals de groene bladeren, een goed contrast kunnen bieden. Eén manier om het contrast te verbeteren, is het monster te behandelen met gekleurde pigmenten of kleurstoffen die binden aan specifieke structuren in het monster. Verschillende soorten microscopie zijn ontwikkeld om het contrast in monsters te verbeteren. De specialisaties bevinden zich voornamelijk in de verlichtingssystemen en de soorten licht die door het monster zijn gegaan. Een donkerveldmicroscoop gebruikt bijvoorbeeld een speciale condensor om het grootste deel van het heldere licht te blokkeren en het preparaat te verlichten met schuin licht, net zoals de maan het licht van de zon blokkeert bij een zonsverduistering. Deze optische opstelling biedt een volledig donkere achtergrond en verbetert het contrast van het beeld om fijne details naar voren te brengen - heldere gebieden bij grenzen binnen het specimen.

Hier zijn de verschillende soorten technieken voor lichtmicroscopie:

  • Helder veld - Dit is de basismicroscoopconfiguratie (de beelden die tot nu toe zijn bekeken, zijn allemaal afkomstig van brightfield-microscopen). Deze techniek heeft heel weinig contrast; in de afbeeldingen die je tot nu toe hebt gezien, is veel van het contrast verkregen door de exemplaren te kleuren.
  • Donker veld - Deze configuratie verbetert het contrast, zoals hierboven vermeld. Zie Molecular Expressions: Darkfield Microscopy voor meer informatie en voorbeelden.
  • Rheinberg-verlichting - Deze opstelling is vergelijkbaar met het donkerveld, maar gebruikt een reeks filters om een ​​"optische kleuring" van het monster te produceren. Zie Molecular Expressions: Rheinberg Illumination voor details en voorbeelden.

De volgende technieken gebruiken hetzelfde basisprincipe als Rheinberg-verlichting, waarbij verschillende resultaten worden bereikt door verschillende optische componenten te gebruiken. Het basisidee bestaat uit het splitsen van de lichtbundel in twee routes die het specimen verlichten. Lichtgolven die door dichte structuren in het preparaat gaan, vertragen in vergelijking met die golven die door minder dichte structuren gaan. Omdat alle lichtgolven worden verzameld en doorgegeven aan het oculair, worden ze gerecombineerd, dus interfereren ze met elkaar. De interferentiepatronen bieden contrast: ze kunnen donkere gebieden (dichter) op een lichte achtergrond (minder dicht) tonen, of een type van een vals driedimensionaal (3-D) beeld creëren.

  • Fasecontrast - Deze techniek is het best voor het kijken naar levende specimens, zoals gekweekte cellen.

In een fasecontrastmicroscoop scheiden de ringvormige ringen in de objectieflens en de condensor het licht. Het licht dat door het centrale deel van het lichtpad gaat, wordt gerecombineerd met het licht dat zich langs de omtrek van het monster verplaatst. De interferentie die door deze twee paden wordt geproduceerd, produceert beelden waarin de dichte structuren donkerder lijken dan de achtergrond. Zie Molecular Expressions: Phase Contrast Microscopy voor meer informatie en voorbeelden.

Hoe lichtmicroscopen werken: lichtmicroscopen

Een fasecontrastbeeld van een gliacelcel gekweekt uit de hersenen van een rat
  • Differentieel interferentiecontrast (DIC) - DIC gebruikt polarisatiefilters en prisma's om de lichtpaden te scheiden en opnieuw te combineren, waardoor het 3D-beeld er driedimensionaal uitziet (DIC wordt ook wel DIFF genoemd) Nomarski naar de man die het heeft uitgevonden). Zie Molecular Expressions: Differential Interference Contrast Microscopy voor meer informatie en voorbeelden.
  • Hoffman-modulatiecontrast - Hoffman-modulatiecontrast is vergelijkbaar met DIC, behalve dat het platen gebruikt met kleine spleten in zowel de as als de off-as van het lichtpad om twee sets lichtgolven te produceren die door het monster gaan. Opnieuw wordt een 3D-afbeelding gevormd. Zie Molecular Expressions: Hoffman Modulation Contrast Microscopy voor meer informatie en voorbeelden.
  • Polarisatie - De gepolariseerde lichtmicroscoop gebruikt twee polarisatoren, één aan elke zijde van het specimen, loodrecht op elkaar geplaatst zodat alleen licht dat door het specimen passeert het oculair bereikt. Licht wordt gepolariseerd in één vlak wanneer het door het eerste filter gaat en het monster bereikt. Regelmatig op afstand van elkaar gelegen, van een patroon voorziene of kristallijne gedeelten van het monster roteren het licht dat er doorheen gaat. Een deel van dit geroteerde licht passeert het tweede polarisatiefilter, dus deze regelmatig gespatieerde gebieden worden helder weergegeven tegen een zwarte achtergrond. Zie Molecular Expressions: Introduction to Polarized Light Microscopy voor meer informatie en voorbeelden.
  • fluorescentie - Dit type microscoop gebruikt hoogenergetisch licht met een korte golflengte (meestal ultraviolet) om elektronen binnen bepaalde moleculen in een monster te exciteren, waardoor deze elektronen naar hogere banen bewegen. Wanneer ze terugvallen op hun oorspronkelijke energieniveaus, stoten ze minder energie uit, met langere golflengten (meestal in het zichtbare spectrum), wat het beeld vormt.

In de volgende sectie bespreken we fluorescentiemicroscopie in meer detail.

Specimen voorbereiding

Wanneer een specimen wordt waargenomen met doorvallend licht, moet het licht door het monster gaan om een ​​beeld te vormen. Hoe dikker het monster, hoe minder licht er doorheen gaat. Hoe minder licht er doorheen valt, hoe donkerder het beeld. Daarom moeten de monsters dun zijn (0,1 tot 0,5 mm). Veel levende exemplaren moeten vóór observatie in dunne delen worden gesneden.Monsters van steen of halfgeleiders zijn te dik om te worden gesneden en waargenomen door doorvallend licht, zodat ze worden waargenomen door het licht dat wordt gereflecteerd vanaf hun oppervlakken.

Fluorescentie-microscopie

Lichtpad van een epifluorescentiemicroscoop

Lichtpad van een epifluorescentiemicroscoop

Een fluorescentiemicroscoop gebruikt een kwik- of xenonlamp om ultraviolet licht te produceren. Het licht komt in de microscoop en raakt a dichroïsche spiegel - een spiegel die een bereik van golflengten reflecteert en een ander bereik toelaat. De dichroïsche spiegel reflecteert het ultraviolette licht tot aan het monster. Het ultraviolette licht exciteert fluorescentie binnen moleculen in het specimen. De objectieflens verzamelt het geproduceerde fluorescentiegolflengtelicht. Dit fluorescerende licht passeert door de dichroïsche spiegel en een barrièrefilter (dat andere golflengten dan fluorescent elimineert), waardoor het naar het oculair wordt gebracht om het beeld te vormen.

De fluorescente moleculen in het specimen kunnen van nature voorkomen of worden geïntroduceerd. U kunt bijvoorbeeld cellen kleuren met een kleurstof die wordt genoemd calceïne / AM. Op zichzelf is deze kleurstof niet fluorescerend. Het AM-gedeelte van het molecuul verbergt een deel van het calceïne-molecuul dat calcium bindt, dat fluorescerend is. Wanneer u de calceïne / AM mengt met de oplossing die de cellen baadt, steekt de kleurstof de cel in. Levende cellen hebben een enzym dat het AM-gedeelte verwijdert, het calceïne in de cel opsluit en het calceïne in staat stelt calcium te binden zodat het groen fluoresceert onder ultraviolet licht. Dode cellen hebben dit enzym niet meer. Daarom zullen levende cellen groen fluoresceren en dode cellen zullen niet fluoresceren. Je kunt de dode cellen in hetzelfde monster zien als je een andere kleurstof mengt die propidiumjodide wordt genoemd en die alleen de dode cellen binnendringt. Propidiumjodide bindt zich aan DNA in de kern en fluoresceert rood onder ultraviolet licht. Deze techniek met dubbele kleurstof wordt gebruikt in toxicologische studies om het percentage van een celpopulatie te bepalen dat wordt gedood wanneer het wordt behandeld met een of ander milieumiddel, zoals een pesticide.

Hoe lichtmicroscopen werken: licht

Fluorescentiebeeld van gekweekte rattenhersenen. Levende cellen kleuren met calceïne (links) en dode cellen kleuren met propidiumjodide (rechts).

Hoe lichtmicroscopen werken: monster

Fluorescentiebeeld van gekweekte rattenhersenen. Levende cellen kleuren met calceïne (links) en dode cellen kleuren met propidiumjodide (rechts).

Fluorescentie-microscopietechnieken zijn nuttig voor het zien van structuren en het meten van fysiologische en biochemische gebeurtenissen in levende cellen. Verschillende fluorescerende indicatoren zijn beschikbaar om vele fysiologisch belangrijke chemicaliën zoals DNA, calcium, magnesium, natrium, pH en enzymen te bestuderen. Bovendien kunnen antilichamen die specifiek zijn voor verschillende biologische moleculen chemisch worden gebonden aan fluorescente moleculen en worden gebruikt voor het kleuren van specifieke structuren in cellen. Zie Molecular Expressions: Fluorescence Microscopy voor meer informatie en meer voorbeelden.

In het volgende gedeelte zullen we de componenten van een lichtmicroscoop en hun functies onderzoeken.

epifluorescentie

is een optische opstelling voor een fluorescentiemicroscoop waarin de objectieflens wordt gebruikt om zowel ultraviolet licht op het monster te focussen en fluorescerend licht van het monster te verzamelen. is efficiënter dan doorgezonden fluorescentie, waarbij een afzonderlijke lens of condensor wordt gebruikt om ultraviolet licht op het monster scherp te stellen. maakt het ook mogelijk dat fluorescentiemicroscopie wordt gecombineerd met een ander type op dezelfde microscoop.

De delen van een lichtmicroscoop

Een lichtmicroscoop, of het nu een eenvoudige studentenmicroscoop is of een complexe onderzoeksmicroscoop, heeft de volgende basissystemen:

  • Modelcontrole - houd het monster vast en manipuleer het stadium - waar het monster rust clips - wordt gebruikt om het monster nog steeds op het podium te houden (omdat u naar een vergroot beeld kijkt, kunnen zelfs de kleinste bewegingen van het preparaat delen van het beeld uit uw gezichtsveld verplaatsen.) micromanipulator - apparaat waarmee u het preparaat in gecontroleerde, kleine stappen langs de x- en y-as kunt verplaatsen (handig voor het scannen van een dia)
  • Verlichting - licht op het monster (het eenvoudigste verlichtingssysteem is een spiegel die het licht van de ruimte door het preparaat reflecteert.) lamp - produceert het licht (Typisch, lampen zijn wolfraam-gloeidraad gloeilampen.Voor speciale toepassingen kunnen kwik- of xenonlampen worden gebruikt om ultraviolet licht te produceren.Sommige microscopen gebruiken zelfs lasers om het specimen te scannen.) weerstand - wijzigt de stroom die op de lamp wordt toegepast om de intensiteit van het geproduceerde licht te regelen condensator - lenssysteem dat het licht van de lamp op het monster uitlijnt en scherpstelt diafragma of pinhole openingen - geplaatst in het lichtpad om de hoeveelheid licht die de condensor bereikt te veranderen (voor het verbeteren van het contrast in het beeld) Diagram van een typische studentenlichtmicroscoop, die de delen en het lichtpad toont
  • lenzen - vorm de afbeelding objectieve lens - verzamelt licht van het monster oculair - zendt en vergroot het beeld van de objectieflens naar uw oog neusstuk - roterende houder die veel objectieve lenzen bevat buis - houdt het oculair op de juiste afstand van de objectieflens en blokkeert strooilicht
  • Focus - plaats de objectieflens op de juiste afstand van het preparaat grof-focusknop - gebruikt om het voorwerp in het brandpuntsvlak van de objectieflens te brengen fijn scherpstelknop - gebruikt om fijne aanpassingen te maken om de afbeelding scherp te stellen
  • Ondersteuning en afstemming arm - gebogen deel dat alle optische delen op een vaste afstand houdt en uitlijnt baseren - ondersteunt het gewicht van alle microscooponderdelen buis is verbonden met de arm van de microscoop door middel van een tandheugelaandrijving.Met dit systeem kunt u het beeld scherpstellen wanneer u lenzen of waarnemers verwisselt en de lenzen bij het verwisselen van monsters uit het werkgebied verwijderen.

Sommige van de hierboven genoemde onderdelen worden niet weergegeven in het diagram en variëren tussen microscopen. Microscopen zijn er in twee basisconfiguraties: rechtop en ondersteboven. De microscoop in het diagram is een rechtopstaande microscoop, met het verlichtingssysteem onder het podium en het lenssysteem boven het podium. Een omgekeerde microscoop heeft het verlichtingssysteem boven het podium en het lenssysteem onder het podium. Omgekeerde microscopen zijn beter voor het kijken door dikke monsters, zoals schalen van gekweekte cellen, omdat de lenzen dichter bij de bodem van de schaal kunnen komen, waar de cellen groeien.

Lichtmicroscopen kunnen de structuren van levende cellen en weefsels onthullen, evenals van niet-levende monsters zoals rotsen en halfgeleiders. Microscopen kunnen eenvoudig of ingewikkeld van ontwerp zijn en sommige kunnen meer dan één type microscopie doen, die elk iets andere informatie onthullen. De lichtmicroscoop heeft onze biomedische kennis sterk verbeterd en is nog steeds een krachtig hulpmiddel voor wetenschappers.

Sommige Microscoop-voorwaarden
  • Scherptediepte - verticale afstand van boven tot onder het brandpuntsvlak, die een acceptabel beeld oplevert
  • Gezichtsveld - gebied van het specimen dat met een bepaalde objectieflens door de microscoop kan worden gezien
  • Brandpuntsafstand - benodigde afstand voor een lens om het licht scherp te stellen (meestal gemeten in micron)
  • Focus / focus - punt waarop het licht van een lens samenkomt
  • Vergroting - product van de vergrotende krachten van het objectief en oculair lenzen
  • Numerieke lensopening - maat van het lichtverzamelvermogen van de lens
  • Resolutie - de twee dichtstbijzijnde objecten kunnen zijn voordat ze niet meer als afzonderlijke objecten worden gedetecteerd (meestal gemeten in nanometers)

Andere goede links

  • Laboratoriumkwaliteitsmicroscopen

Algemene informatie

  • Lichtmicroscopie
  • UCLA Brain Research Institute Microscopy Core Facilities
  • TOPS Learning Systems: TOPScopes
  • PocketScope.com

Zelfstudies en virtuele microscopen

  • MOLECULAIRE EXPRESSIES: Onderzoek naar de wereld van optica en microscopie
  • Nikon: MicroscopyU
  • Olympus Microscopy Resource Center

Organisaties, Educatieve informatie, Bronnen voor de industrie

  • Microscopie Society of America (MSA) Startpagina
  • Microscopie Society of America: Project Micro
  • MicroWorld: Selected Microscopy Resources voor K-12 Education
  • 101Science.com: microscopen
  • MicroWorld: gids voor bronnen voor online microscopie en microanalyse
  • Microscopy-Online.com
Hoe Lichtmicroscopen Werken

FAQ - 💬

❓ Hoe werkt een lichtmicroscoop?

👉 Een lichtmicroscoop gebruikt verschillende soorten licht om het object zichtbaar te maken. Met behulp van lenzen vergroot de lichtmicroscoop het beeld van het preparaat. Hoe sterker de lenzen, hoe verder het apparaat het object kan vergroten. Tegenwoordig kunnen we met een lichtmicroscoop objecten 2000x vergroten.

❓ Kan je bacterien met een lichtmicroscoop zien?

👉 Een bacterie is een cel zonder celkern en wordt ook wel een micro-organisme genoemd. Ze zijn zo klein, dat ze nog net met de lichtmicroscoop te zien zijn. Bacteriën zien er onder de microscoop uit als bolletjes, staafjes of spiraaltjes.

❓ Wat kun je zien met een lichtmicroscoop?

👉 Lichtmicroscopen worden ingezet om objecten te bestuderen in de ordegrootte van 1 µm (een duizendste millimeter) tot 5 mm.

❓ Waarom mag je met de Macroschroef nooit de tafel omhoog draaien als je in het oculair kijkt?

👉 Je gebruikt dan alleen nog maar de kleine stelschroef. Als je op grote vergrotingen draait met de grote stelschroef, dan is de kans groot dat de lens van het objectief tegen het preparaat aankomt en wordt beschadigd. Als je door het oculair kijkt, zie een streepje in beeld.Сохраненная копия

❓ Kan je een virus zien onder de microscoop?

👉 Met de elektronen microscoop (EM) kunnen virussen zichtbaar worden gemaakt. Aanwezigheid van virus in een patiëntenmateriaal kan een belangrijke verklaring zijn voor de ziekte van een patiënt. Wanneer een virus ziekte veroorzaakt is dit aanwezig in cellen, weefsels en vaak ook in lichaamsvloeistoffen.

❓ Kan je atomen zien met een microscoop?

👉 "Met de nieuwe microscoop kunnen we niet alleen naar atomen kijken, maar ook naar de elektronen eromheen", legt Van Huis uit. "Zo kunnen we ook zien of er elektrische lading op de atomen zit, en of atomen zich in een aangeslagen toestand bevinden.


Video Supplement: Werken met de Microscoop.




WordsSideKick.com
Alle Rechten Voorbehouden!
Reproductie Van Materialen Toegestaan Alleen Prostanovkoy Actieve Link Naar De Site WordsSideKick.com

© 2005–2024 WordsSideKick.com